Nacido en Pesaro, en las Marcas, Zacconi se convirtió en fraile agustino en Venecia, donde fue ordenado sacerdote. En 1577 estaba en Venecia estudiando en la iglesia de San Stefano, y en algún momento de los seis años siguientes fue aceptado por Andrea Gabrieli como estudiante de contrapunto. Trabajó como cantante, teólogo y escritor musical en el norte de Italia y Austria; durante un tiempo estuvo al servicio del archiduque Carlos de Graz y trabajó en Graz y Viena.
En 1584 hizo una audición en San Marco como cantante y fue aceptado; sin embargo, parece haber rechazado el puesto. También en esta época conoció a Zarlino, el destacado teórico de la escuela veneciana; mencionaría el encuentro en la segunda parte de su “Prattica di musica” (1622). El 20 de julio de 1585 se incorporó al establecimiento musical del archiduque Carlos de Graz, cargo que mantuvo hasta la muerte de Carlos en 1590. Posteriormente, se incorporó a la capilla de Guillermo V, duque de Baviera, que estaba dirigida por Orlande de Lassus.

En 1596 dejó el empleo de Wilhelm y regresó a Italia; en los años siguientes trabajó como prior en Pesaro y como predicador y administrador tanto en Italia como en Creta. Se retiró a Pesaro en 1612, donde permaneció hasta su muerte a los 71 años de edad. La fama de Zacconi se basa en su gran obra “Prattica di Musica”, publicada por primera vez en 1592 en Venecia, de la que apareció un segundo volumen en 1619 (o, según otras fuentes, en 1622). Sus obras teóricas son conservadoras y no mencionan el estilo barroco emergente, a pesar de sus estudios con el distinguido compositor veneciano Andrea Gabrieli. Sus obras más importantes son los dos libros de “Prattica di musica”, que contienen cuatro obras, tratan exhaustivamente la teoría musical y están copiosamente ilustrados. Las instrucciones para interpretar música polifónica son de gran valor, especialmente las ilustraciones de Palestrina. Se ocupa plenamente de los seis Modos Auténtico y los seis Modos Plagal, omitiendo cuidadosamente los Modos Locrio e Hipocrio. Pero también trata de los instrumentos orquestales (su compás y método de ejecución) y brinda información valiosa sobre la partitura de las primeras óperas y oratorios. De hecho, cubre todo el ámbito de la música, tal como se practicaba a finales del siglo XVI.

Los tratados de Zacconi son una guía invaluable para el estudio de la práctica interpretativa de la música vocal del Renacimiento tardío. Partes de su obra fueron incorporadas por Michael Praetorius en su Syntagma musicum (1618) y por Pietro Cerone en su Melopeo y maestro (1613).